快速理解mRNA疫苗關鍵技術

已在台灣實現的製程

(Overview of mRNA vaccine technology and what has been implemented in Taiwan)

     前言:
              mRNA疫苗是將目標抗原的基因序列以基因工程的方式,將其DNA序列構築至適合的DNA質體(plasmid)或載體(vector),再以分子生物技術將DNA vector中的對應的RNA序列轉錄(transcription)RNA,唯工廠生產RNA並不是透過生物體,而是以體外合成的方式,體外合成需先做出RNA,再進一步修改為mRNA,修改時需加上帽端(cap)及長片段A (poly-A),各家製成mRNA方式略微不同,但整個mRNA的標準結構由5’端至 3’端依序為帽端子(cap)–5’端非轉譯區(5’UTR)、目標蛋白轉譯區(ORF)3’端非轉譯區(3’UTR)及聚合體(A)(poly(A)tail),生產的RNA再以適合的傳送技術送至人體細胞,再由細胞依據送mRNA轉譯出對應的目標抗原蛋白,與一般直接將蛋白打入人體以產生抗體的疫苗技術與原理不同,此mRNA技術的優點為在設計和構建上具有快速性、應變性以及可以簡單的以全合成設計序列等優勢,適合突變快速的病毒,如新型冠狀病毒在全球範圍爆發和蔓延後,隨著病毒的變化可快速生產相應的mRNA疫苗。因為Pfizer/BNTModernamRNA疫苗在臨床上的安全性和保護效力得到優異的成效後,使得mRNA疫苗技術得到廣泛關注並推動了其快速發展。相比於其他類型的疫苗,mRNA疫苗藥學研發、保存、運送及在人體的傳送系統的建立至關重大,mRNA疫苗開發的關鍵技術流程如下:

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mRNA 疫苗生產示意圖:可略分為DNA原液製造、RNA原液製造、mRNA製劑與冷鏈保存三大階段  

Sample 2 for three columns

2.RNA原液生產

(詳細介紹點此鏈結)

Sample 3 for three columns

3.mRNA 製劑與冷鏈保存

(詳細介紹點此鏈結)

鴻林堂生技目前在mRNA疫苗生產的相關技術能力
      鴻林堂生技已經在台灣累積多年mRNA前端相關技術之開發經驗,後端技術近期亦有相關成果與規劃如下。目前以綠色螢光蛋白為模式,製成mRNA脂質納米顆粒(LNP)後,再以細胞試驗,明顯觀察到綠色螢光蛋白的表現,詳下圖。足見本公司在mRNA製造工藝已有一定技術能力與水準,於新冠肆虐2年來,希望能透過本公司的技術,為台灣及世界在mRNA疫苗供獻一份心力。

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鴻林堂生技公司在mRNA 疫苗製造中已完成開發及開發中的相關技術

1 DNA plasmid 生產部分

1.1 DNA 點突變技術(point mutation)可快速應變病毒的序列變化進行突變設計與生產

1.2 plasmid DNA 量產技術, 其中包括

(1) 
內毒素移除技術(endotoxin remove)
(2) RNA 移除技術( RNA remove)
(3) gDNA 移除技術(genomic DNA remove)

1.3 目前已建立DNA 模板系統


(1)  Pfizer/BNT  棘蛋白(spike protein)的全長序列 ( 含Delta, C2, Mu 病毒株的衍生序列)
(2) Modenra 棘蛋白(spike protein)的全長序列
(3) SMOBiO自行設計棘蛋白(spike protein)的全長序列及較長poly (A) tail(200~300 A tail)設計
(4)  綠色螢光蛋白(GFP) 序列

1.4 已建立 DNA模板系統圖示(依各家提供的序列設計並構築,其中Moderna以其提供的CDS部分 進行 設計。
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Sequence Map連結下載:(請用另存新檔方式下載)

pSK-BNT-Swt (以BNT提供棘蛋白序列設計) (gb檔案下載) (PDF檔案下載)

pSK-Moderan-Swt (以Moderna提供棘蛋白序列設計) (gb檔案下載) (PDF檔案下載)

pSK-SMBiO-Swt (鴻林堂自行設計棘蛋白) (gb檔案下載) (PDF檔案下載)

pSK-GFP (以GFP序列設計) (gb檔案下載) (PDF檔案下載)

2. mRNA 生成

2.1 In vitro transcription系統:


(1) T7 RNA polymerase

T7 RNA聚合酶純化電泳圖, whole(全部菌裂解液、Sup(上清液)、pellet(不溶沈澱物)、 Ft (未結合流出液)、Elute(純化)。

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(2) RNase inhibitor (RNA酶抑制物)

RNA酶抑制物純化電泳圖, whole(全部菌裂解液、Sup(上清液)、pellet(不溶沈澱物)、 Ft (未結合流出液)、 W(清洗液)、 Elute(純化)。

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(3)核苷酸單體材料:

NTP: ATP、UTP、CTP、GTP、ψTP、N-methyl ψTP 無磷酸形式:A、U、 C、G、ψ、N-methyl ψ 之鹼基五碳醣。

由Uracil生產製造ψTP 過程中HPLC監控

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由ψ0P (無磷酸) 至N1mψ0P生產製造過程中HPLC監控

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ψ的Mass, NMR結果如下:

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ψ的 H NMR:

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Pseudouridine 碳譜NMR (13C NMR):

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(4) 痘病毒加帽端酶 (Vaccinia caping enzymes)含D1, D12

D1, D12酶純化電泳圖, whole(全部菌裂解液、Sup(上清液)、pellet(不溶沈澱物)、 Ft (未結合流出液)、 W(清洗液)、 Elute(純化)。 D1蛋白仍待進一步調整純化中。

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(5)2′O-甲基轉移酶 (2′O -methyltransferase)

2’-O methyltransferase 酶純化電泳圖, whole(全部菌裂解液、Sup(上清液)、pellet(不溶沈澱物)、 Ft (未結合流出液)、 W(清洗液)、 Elute(純化)。

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(6)無機焦磷酸酶 (Inorganic Pyrophosphatase)

Inorganic Pyrophosphatase 無機焦磷酸酶純化電泳圖, whole(全部菌裂解液、Sup(上清液)、pellet(不溶沈澱物)、 Ft (未結合流出液)、 W(清洗液)、 Elute(純化)。

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2.2 RNA (mRNA)提純技術:oligo-dT resin(磁珠)技術開發中

3. mRNA奈米顆粒脂質包裏技術 (mRNA LNP)

(1) 關鍵陽離子脂質量產合成技術
      ALC 0315陽離子脂質量產

ALC-0315 Mass

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ALC-0315氫譜 NMR

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ALC-0315 碳譜NMR

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鴻林堂生技合成 ALC0315的(A)原液 及( B)溶於乙醇的狀態

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(2)mRNA LNP微流控混合技術

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