2. RNA原液生產

 RNA原液的生產，可細分為三個階段，茲分述如下:

一. 體外轉錄

（In Vitro Transcription，IVT）RNA

  RNA 體外合成除了DNA原液之外，還需要多種酵素及核苷酸原料完成RNA的體外轉錄反應，茲將各種中會被採用的酵素與原料分述如下 :

(1)T7 RNA 聚合酶：可辨識T7 啟動子，並將其後的DNA序列轉錄成RNA。

(2)RNase  抑制物(RNase inhibitor):可專一性結合RNA分解酶(RNase A)，可提高反應過程中，RNA免受RNA分解酶的作用，以維持RNA的品質。

(3) 核苷酸原物料：為RNA單體的原料，包括常見的ATP、UTP、CTP及GTP，此外生物體為了增加RNA的穩定性有相應的修飾核苷酸，如例如 BNT/Pfizer與Moderna採用N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸（m1ψTP）取代UTP以提高RNA的穩定性及轉譯的效率。
(4) 無機焦磷酸酶：其作用可 增加RNA產量，因RNA合成中，會產生大量的焦磷酸，焦磷酸酶（PPase）可催化無機焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽，降低無機焦磷酸的累積，促使RNA合成反應效率的提升。 

鴻林堂於2015年有生產RNA的技術，當時已可生產200~6kb的RNA片段，並將生產各種不同長度的RNA進一步組成各種分子量(長度)的RNA標準品( RNA marker)，下圖即為當時開發生產過程的圖示。

CMS - a big picture
CMS - a big picture

上圖為鴻林堂生技於2016年型錄中RNA marker 的照片 資訊分享2：鴻林堂生技於2021年8月已採用自行生產T7 RNA聚合酶、核苷酸(含三磷酸假尿苷 ψ)、RNA 抑制物、及依據Pfizer/BNT的序列架構進行合成與設計出DNA質體，執行RNA的生產出新冠病毒棘蛋白  mRNA如下圖。

CMS - a big picture

二. RNA修飾

RNA的修飾主要包括加帽頭端、加poly(A)尾端、頭端甲基化(methylation)等三種修飾，分述如下

(1)   加帽端：帽端(cap)為 RNA轉譯蛋白時所需的結構，可與eIf4E結合，為生物細胞內進行RNA的關鍵之一，此外加帽端的反應，可保護RNA的5’端，提高RNA穩定性，加帽端的方式有兩種，一種是一步法RNA合成，為BNT/Pfizer採用於mRNA的合成，是在RNA合成時添加帽端的類似物 (cap analog)於反應中，故加帽端與RNA合成是在同一個反應進行，另一種為兩步法，為Moderna公司合成mRNA所採用，是以痘病毒加帽端酶，將GTP修改為cap，並將cap加上RNA的作法，此法常與痘苗2′O-甲基轉移酶一起執行。
(2) 甲基化：可提高RNA的穩定性，除了加帽端之外，5’端的RNA核酸分子可被甲基化以提高RNA的穩定性，如痘苗2′O-甲基轉移酶 (2’O-methyltransferase)可在cap-1(即在cap 之後的第一及第二位置的核苷酸)將核苷酸的五碳醣第二個O的位置進行甲基化。

(3) 加poly(A)尾端: 成熟的 mRNA具有poly(A)尾端，是 mRNA的基本結構，與RNA的穩定性及轉譯效率有關。將RNA加poly(A)尾的方式有兩種，一種是如前面所述，於DNA質體設計時，就將polyA的序列設計入質體中，則所合成的RNA就帶有poly(A)尾，另一種是在合成RNA之後，再以Poly(A)聚合酶在3’端加上poly(A)。

三. RNA純化

RNA純化包括幾個步驟，DNA模版去除，及RNA的純化

(1) DNA模版去除：此步驟是為了控管所生產的RNA沒有DNA的殘留，一般的去除方式是利用DNase 將DNA分解掉，只保留RNA。

(2) RNA純化 :  DNA分解後，需進一步將RNA從溶液中純化出來，目前純化的工藝有，oligo-T的磁珠、oligo-T的層析柱、LiCl或LiOAc的沈降分離及切向流過濾TFF等技術。

     
      於RNA生產的過程中，需要導入很多酶及原物料，但這些物質在製成疫苗前皆需要被移除，例如DNA、DNase、proteinase K都必需被移除，甚至RNA合成過程中，也有機率產生不完整或雙股RNA或DNA-RNA組合皆可能被細胞特定識別受體識別，並觸發先天免疫，誘導I型干擾素的表達，進而降低蛋白質的轉譯。目前比較常用的RNA純化技術是採用oligo-T的純化技術，因為核苷酸A與T的配對具有專一性，oligo-T可和poly(A) 可在中性或高鹽條件結合，並於低鹽或純水中純化出RNA，以目前的技術RNA回收率可達90%以上水準。
     
        mRNA原液的品質管控包括mRNA含量、純度、產品相關雜質(如不完整mRNA、雙股RNA等)還包括mRNA的核酸序列正確性、加帽端率、Poly(A)尾長度等結構，皆需於過程中進行控管。RNA含量一般以波長260、280的紫外光吸光值法進行檢測，序列正確性可將RNA反轉錄為DNA後再進行測序。加帽端率、PolyA長度以及修飾核苷酸檢測一般採用質譜法分析RNA全長或個別的分子量，是mRNA品質管控的重點。