2. RNA原液生產

 RNA原液的生產,可細分為三個階段,茲分述如下:

一. 體外轉錄

(In Vitro Transcription,IVT)RNA

  RNA 體外合成除了DNA原液之外,還需要多種酵素及核苷酸原料完成RNA的體外轉錄反應,茲將各種中會被採用的酵素與原料分述如下 :

(1)T7 RNA 聚合酶:可辨識T7 啟動子,並將其後的DNA序列轉錄成RNA

(2)RNase  抑制物(RNase inhibitor):可專一性結合RNA分解酶(RNase A),可提高反應過程中,RNA免受RNA分解酶的作用,以維持RNA的品質。

(3) 核苷酸原物料:RNA單體的原料,包括常見的ATPUTPCTPGTP,此外生物體為了增加RNA的穩定性有相應的修飾核苷酸,如例如 BNT/Pfizer與Moderna採用N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸(m1ψTP)取代UTP以提高RNA的穩定性及轉譯的效率。
(4) 無機焦磷酸酶:其作用可 增加RNA產量,因RNA合成中,會產生大量的焦磷酸,焦磷酸酶(PPase)可催化無機焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽,降低無機焦磷酸的累積,促使RNA合成反應效率的提升。 

鴻林堂於2015年有生產RNA的技術,當時已可生產200~6kb的RNA片段,並將生產各種不同長度的RNA進一步組成各種分子量(長度)的RNA標準品( RNA marker),下圖即為當時開發生產過程的圖示。

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上圖為鴻林堂生技於2016年型錄中RNA marker 的照片 資訊分享2:鴻林堂生技於2021年8月已採用自行生產T7 RNA聚合酶、核苷酸(含三磷酸假尿苷 ψ)、RNA 抑制物、及依據Pfizer/BNT的序列架構進行合成與設計出DNA質體,執行RNA的生產出eGFP  mRNA如下圖。

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二. RNA修飾

RNA的修飾主要包括加帽頭端、加poly(A)尾端、頭端甲基化(methylation)等三種修飾,分述如下

(1)   加帽端:帽端(cap)為 RNA轉譯蛋白時所需的結構,可與eIf4E結合,為生物細胞內進行RNA的關鍵之一,此外加帽端的反應,可保護RNA5’端,提高RNA穩定性,加帽端的方式有兩種,一種是一步法RNA合成,為BNT/Pfizer採用於mRNA的合成,是在RNA合成時添加帽端的類似物 (cap analog)於反應中,故加帽端與RNA合成是在同一個反應進行,另一種為兩步法,為Moderna公司合成mRNA所採用,是以痘病毒加帽端酶,將GTP修改為cap,並將cap加上RNA的作法,此法常與痘苗2′O-甲基轉移酶一起執行。
(2) 甲基化:可提高RNA的穩定性,除了加帽端之外,5’端的RNA核酸分子可被甲基化以提高RNA的穩定性,如痘苗2′O-甲基轉移酶 (2’O-methyltransferase)可在cap-1, cap-2(即在cap 之後的第一及第二位置的核苷酸)將核苷酸的五碳醣第二個O的位置進行甲基化。

(3) poly(A)尾端: 成熟的 mRNA具有poly(A)尾端,是 mRNA的基本結構,與RNA的穩定性及轉譯效率有關。將RNApoly(A)尾的方式有兩種,一種是如前面所述,於DNA質體設計時,就將polyA的序列設計入質體中,則所合成的RNA就帶有poly(A)尾,另一種是在合成RNA之後,再以Poly(A)聚合酶在3’端加上poly(A)

三. RNA純化

RNA純化包括幾個步驟,DNA模版去除,及RNA的純化

(1) DNA模版去除:此步驟是為了控管所生產的RNA沒有DNA的殘留,一般的去除方式是利用DNase DNA分解掉,只保留RNA

(2) RNA純化 :  DNA分解後,需進一步將RNA從溶液中純化出來,目前純化的工藝有,oligo-T的磁珠、oligo-T的層析柱、LiCl或LiOAc的沈降分離及切向流過濾TFF等技術。

     
      於RNA生產的過程中,需要導入很多酶及原物料,但這些物質在製成疫苗前皆需要被移除,例如DNA、DNase、proteinase K都必需被移除,甚至RNA合成過程中,也有機率產生不完整或雙股RNA或DNA-RNA組合皆可能被細胞特定識別受體識別,並觸發先天免疫,誘導I型干擾素的表達,進而降低蛋白質的轉譯。目前比較常用的RNA純化技術是採用oligo-T的純化技術,因為核苷酸A與T的配對具有專一性,oligo-T可和poly(A) 可在中性或高鹽條件結合,並於低鹽或純水中純化出RNA,以目前的技術RNA回收率可達90%以上水準。
     
        mRNA原液的品質管控包括mRNA含量、純度、產品相關雜質(如不完整mRNA、雙股RNA等)還包括mRNA的核酸序列正確性、加帽端率、Poly(A)尾長度等結構,皆需於過程中進行控管。RNA含量一般以波長260、280的紫外光吸光值法進行檢測,序列正確性可將RNA反轉錄為DNA後再進行測序。加帽端率、PolyA長度以及修飾核苷酸檢測一般採用質譜法分析RNA全長或個別的分子量,是mRNA品質管控的重點。